M-MLV ਨਿਓਸਕ੍ਰਿਪਟ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ
ਨਿਓਸਕ੍ਰਿਪਟ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਇੱਕ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਹੈ ਜੋ ਮੋਲੋਨੀ ਮਿਊਰੀਨ ਲਿਊਕੇਮੀਆ ਵਾਇਰਸ ਦੀ ਉਤਪਤੀ ਅਤੇ ਈ.ਕੋਲੀ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੇ M-MLV ਜੀਨ ਦੀ ਪਰਿਵਰਤਨ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਐਨਜ਼ਾਈਮ RNase H ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਹਟਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨ ਸਹਿਣਸ਼ੀਲਤਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਉੱਚ-ਤਾਪਮਾਨ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਲਈ ਢੁਕਵਾਂ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਇਹ ਸੀਡੀਐਨਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ 'ਤੇ ਆਰਐਨਏ ਉੱਚ-ਪੱਧਰੀ ਬਣਤਰ ਅਤੇ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਕਾਰਕਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਕੂਲ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਨ ਲਈ ਸਹਾਇਕ ਹੈ, ਅਤੇ ਉੱਚ ਸਥਿਰਤਾ ਅਤੇ ਉਲਟ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਸਮਰੱਥਾ ਹੈ।ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਵਿੱਚ ਉੱਚ ਸਥਿਰਤਾ ਅਤੇ ਉਲਟ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਸਮਰੱਥਾ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।
ਕੰਪੋਨੈਂਟਸ
1.200 U/μL ਨਿਓਸਕ੍ਰਿਪਟ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ
2.5 × ਪਹਿਲਾ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਬਫਰ (ਵਿਕਲਪਿਕ)
* 5 × ਫਸਟ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਬਫਰ ਵਿੱਚ dNTP ਨਹੀਂ ਹੈ, ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਨੂੰ ਤਿਆਰ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ dNTP ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ
ਸਿਫ਼ਾਰਿਸ਼ ਕੀਤੀ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨ
1.ਇੱਕ-ਕਦਮ qRT-PCR।
2.RNA ਵਾਇਰਸ ਖੋਜ.
ਸਟੋਰੇਜ ਦੀ ਸਥਿਤੀ
-20 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਲਈ ਸਟੋਰੇਜ ਲਈ, ਵਰਤੋਂ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਮਿਲਾਇਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਵਾਰ-ਵਾਰ ਜੰਮਣ ਤੋਂ ਪਰਹੇਜ਼ ਕਰੋ।
ਯੂਨਿਟ ਪਰਿਭਾਸ਼ਾ
ਇੱਕ ਯੂਨਿਟ ਪੌਲੀ(A)•oligo(dT) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ 37°C 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਵਿੱਚ 1 nmol dTTP ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਦੀ ਹੈ।25ਟੈਂਪਲੇਟ/ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ।
ਗੁਣਵੱਤਾ ਕੰਟਰੋਲ
1.SDS-PAGE ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਟਿਕ ਸ਼ੁੱਧਤਾ 98% ਤੋਂ ਵੱਧ।
2.ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ, ਬੈਚ-ਟੂ-ਬੈਚ ਕੰਟਰੋਲ, ਸਥਿਰਤਾ।
3.ਕੋਈ ਐਕਸੋਜੇਨਸ ਨਿਊਕਲੀਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨਹੀਂ, ਕੋਈ ਐਕਸੋਜੇਨਸ ਐਂਡੋਨਿਊਕਲੀਜ਼ ਜਾਂ ਐਕਸੋਨਿਊਕਲੀਜ਼ ਗੰਦਗੀ ਨਹੀਂ
ਪਹਿਲੀ ਚੇਨ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਹੱਲ ਲਈ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਸੈੱਟਅੱਪ
1.ਪ੍ਰਤੀਕਰਮ ਮਿਸ਼ਰਣ ਦੀ ਤਿਆਰੀ
| ਕੰਪੋਨੈਂਟਸ | ਵਾਲੀਅਮ |
| ਓਲੀਗੋ(dT)12-18 ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਜਾਂ ਰੈਂਡਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰa ਜਾਂ ਜੀਨ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| ਟੈਂਪਲੇਟ RNA | ਕੁੱਲ RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNase-ਮੁਕਤ dH2O | ਤੋਂ 10 μL |
ਨੋਟ:a/b: ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਆਪਣੀਆਂ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਲੋੜਾਂ ਅਨੁਸਾਰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਚੁਣੋ।
2.5 ਮਿੰਟ ਲਈ 65 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਗਰਮ ਕਰੋ ਅਤੇ 2 ਮਿੰਟ ਲਈ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਠੰਢਾ ਕਰੋ।
3.ਉਪਰੋਕਤ ਸਿਸਟਮ ਵਿੱਚ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ ਕੁੱਲ 20µL ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ ਅਤੇ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਮਿਲਾਓ:
| ਕੰਪੋਨੈਂਟਸ | ਵਾਲੀਅਮ (μL) |
| 5 × ਪਹਿਲਾ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਬਫਰ | 4 |
| ਨਿਓਸਕ੍ਰਿਪਟ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ (200 U/μL) | 1 |
| RNase ਇਨਿਹਿਬਟਰ (40 U/μL) | 1 |
| RNase-ਮੁਕਤ dH2O | ਤੋਂ 20 μL |
4. ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੀਆਂ ਸ਼ਰਤਾਂ ਅਨੁਸਾਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਕਰੋ:
(1) ਜੇਕਰ ਰੈਂਡਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 25℃ ਅਤੇ ਫਿਰ 30~60 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 50℃ ਤੇ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ;
(2) ਜੇਕਰ Oligo dT ਜਾਂ ਖਾਸ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਤਾਂ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ 30~60 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 50℃ 'ਤੇ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।
5.ਨਿਓਸਕ੍ਰਿਪਟ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਨੂੰ ਅਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕਰਨ ਅਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਨ ਲਈ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ 95℃ 'ਤੇ ਗਰਮ ਕਰੋ।
6.ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ ਸਿੱਧੇ PCR ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਅਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਤਰਾਤਮਕ PCR ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਾਂ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਲਈ -20℃ 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਪੀਸੀਆਰ ਆਰਕਾਰਵਾਈ:
1.ਪ੍ਰਤੀਕਰਮ ਮਿਸ਼ਰਣ ਦੀ ਤਿਆਰੀ
| ਕੰਪੋਨੈਂਟਸ | ਧਿਆਨ ਟਿਕਾਉਣਾ |
| 10 × PCR ਬਫਰ (dNTP ਮੁਫ਼ਤ, Mg²+ ਮੁਫ਼ਤ) | 1× |
| dNTPs (10mm ਹਰੇਕ dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 ਮਿ.ਮੀ |
| ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ (5U/μL) | 2-2.5 ਯੂ |
| ਪ੍ਰਾਈਮਰ 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| ਪ੍ਰਾਈਮਰ 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| ਟੈਂਪਲੇਟa | ≤10% ਪਹਿਲਾ ਚੇਨ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਹੱਲ (2 μL) |
| ddH2O | ਤੋਂ 50 μL |
ਨੋਟ:a: ਜੇਕਰ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਪਹਿਲੀ ਚੇਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਘੋਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
2.ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ
| ਕਦਮ | ਤਾਪਮਾਨ | ਸਮਾਂ | ਸਾਈਕਲ |
| ਪ੍ਰੀ-ਡੈਨਚਰੇਸ਼ਨ | 95℃ | 2-5 ਮਿੰਟ | 1 |
| ਵਿਕਾਰ | 95℃ | 10-20 ਸਕਿੰਟ | 30-40 |
| ਐਨੀਲਿੰਗ | 50-60℃ | 10-30 ਸਕਿੰਟ | |
| ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ | 72℃ | 10-60 ਸਕਿੰਟ |
ਨੋਟਸ
1.42℃~55℃ ਦੀ ਰੇਂਜ ਵਿੱਚ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤਾਪਮਾਨ ਅਨੁਕੂਲਨ ਲਈ ਉਚਿਤ।
2.ਇਸ ਵਿੱਚ ਬਿਹਤਰ ਸਥਿਰਤਾ ਹੈ, ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਲਈ ਢੁਕਵਾਂ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਇਹ RNA ਦੇ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਢਾਂਚਾਗਤ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨਾਲ ਲੰਘਣ ਲਈ ਅਨੁਕੂਲ ਹੈ।ਨਾਲ ਹੀ, ਇਹਵਨ-ਸਟੈਪ ਮਲਟੀਪਲੈਕਸ ਫਲੋਰਸੈਂਸ ਮਾਤਰਾਤਮਕ RT-PCR ਖੋਜ ਲਈ ਢੁਕਵਾਂ ਹੈ।
3.ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਚੰਗੀ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਅਤੇ ਉੱਚ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ RT-PCR ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਲਈ ਢੁਕਵੀਂ ਹੈ।
4.ਉੱਚ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਇੱਕ-ਕਦਮ ਫਲੋਰਸੈਂਸ ਮਾਤਰਾਤਮਕ RT-PCR ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਲਈ ਅਨੁਕੂਲ, ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਦੀ ਘੱਟ ਤਵੱਜੋ ਦੀ ਖੋਜ ਦਰ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਸੁਧਾਰਦਾ ਹੈ।
5.cDNA ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਨਿਰਮਾਣ ਲਈ ਉਚਿਤ।
