mRNA Cap2'-O-Methyltransferase
mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase ਇੱਕ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ E. ਕੋਲੀ ਸਟ੍ਰੇਨ ਤੋਂ ਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ ਵੈਕਸੀਨਿਆ mRNA ਕੈਪ 2 ´-O-Methyltransferase ਲਈ ਜੀਨ ਲੈ ਕੇ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਐਨਜ਼ਾਈਮ RNA ਦੇ 5'ਅੰਤ 'ਤੇ ਕੈਪ ਬਣਤਰ ਦੇ ਨਾਲ ਲੱਗਦੇ ਪਹਿਲੇ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਦੀ 2´-O ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਇੱਕ ਮਿਥਾਇਲ ਗਰੁੱਪ ਜੋੜਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਐਨਜ਼ਾਈਮ S-adenosylmethionine (SAM) ਨੂੰ ਮਿਥਾਈਲ ਡੋਨਰ ਵਜੋਂ ਮਿਥਾਈਲ ਕੈਪਡ RNA (ਕੈਪਡ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦਾ ਹੈ। -0) ਕੈਪ-1 ਬਣਤਰ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ।
Cap1 ਢਾਂਚਾ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਅਤੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਇਨਜੈਕਸ਼ਨ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ mRNA ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾ ਕੇ, ਅਨੁਵਾਦ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਨੂੰ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਬਸਟਰੇਟ ਵਜੋਂ m7GpppN ਕੈਪ ਦੇ ਨਾਲ RNA ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਇਹ 5´ ਦੇ ਅੰਤ 'ਤੇ pN, ppN, pppN ਜਾਂ GpppN ਨਾਲ RNA ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਕੈਪਡ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਕੈਪ ਐਨਾਲਾਗ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਜਾਂ ਵੈਕਸੀਨੀਆ ਕੈਪਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਕੈਪਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਕੰਪੋਨੈਂਟਸ
mRNA ਕੈਪ 2´-ਓ-ਮਿਥਾਇਲਟ੍ਰਾਂਸਫੇਰੇਸ (50U/μL)
10×ਕੈਪਿੰਗ ਰਿਐਕਸ਼ਨ ਬਫਰ
ਸਟੋਰੇਜ
ਸਟੋਰੇਜ ਲਈ -25 ～- 15℃
ਸਟੋਰੇਜ ਬਫਰ
20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% ਟ੍ਰਾਈਟਨ X- 100, 50% ਗਲਾਈਸਰੋਲ।
ਯੂਨਿਟ ਦੀ ਪਰਿਭਾਸ਼ਾ
ਇੱਕ ਯੂਨਿਟ ਨੂੰ 37°C 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਵਿੱਚ 80 nt ਕੈਪਡ RNA ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟ ਦੇ 10 pmoles ਨੂੰ ਮਿਥਾਈਲੇਟ ਕਰਨ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਵਜੋਂ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।
ਕੁਆਲਿਟੀ ਕੰਟਰੋਲ ਅਸੈਸ
Exonuclease:50U ਦਾ mRNA ਕੈਪ 2 ´ -O-Methyltransferase 1μg λ-ਹਿੰਦ III ਡਾਇਜੈਸਟ ਡੀਐਨਏ 37 ℃ 'ਤੇ 16 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਐਗਰੋਸ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੋਈ ਵੀ ਗਿਰਾਵਟ ਨਹੀਂ ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ।
ਐਂਡੋਨਿਊਕਲੀਜ਼: 16 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ 37℃ 'ਤੇ 1 μg λDNA ਦੇ ਨਾਲ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ਦਾ 50 U, ਐਗਰੋਸ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੋਈ ਗਿਰਾਵਟ ਨਹੀਂ ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ।
ਨਿਕਸੇ: 16 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ 37 ℃ 'ਤੇ 1μg pBR322 ਦੇ ਨਾਲ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ਦਾ 50U ਐਗਰੋਸ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੋਈ ਵੀ ਗਿਰਾਵਟ ਨਹੀਂ ਦਿੰਦਾ।
RNase: 50U ਦਾ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase 1.6μg MS2 RNA ਦੇ ਨਾਲ 37℃ 'ਤੇ 4 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਐਗਰੋਜ਼ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਿਤ ਕੋਈ ਗਿਰਾਵਟ ਪੈਦਾ ਨਹੀਂ ਕਰਦਾ।
E. ਕੋਲੀ ਡੀ.ਐਨ.ਏ: mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ਦੇ 50U ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਲਈ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।E. ਕੋਲੀ ਲਈ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਨਾਲ TaqMan qPCR ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀ.ਐਨ.ਏE. ਕੋਲੀ 16S rRNA ਟਿਕਾਣਾ।ਦE. ਕੋਲੀ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਗੰਦਗੀ =1 ਹੈE. ਕੋਲੀ ਜੀਨੋਮ
ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਐਂਡੋਟੌਕਸਿਨ: LAL-ਟੈਸਟ, ਚੀਨੀ ਫਾਰਮਾਕੋਪੀਆ IV 2020 ਐਡੀਸ਼ਨ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਜੈੱਲ ਸੀਮਾ ਟੈਸਟ ਵਿਧੀ, ਆਮ ਨਿਯਮ (1143)।ਬੈਕਟੀਰੀਅਲ ਐਂਡੋਟੌਕਸਿਨ ਸਮੱਗਰੀ = 10 EU/mg ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।
ਪ੍ਰਤੀਕਰਮ ਸਿਸਟਮ ਅਤੇ ਹਾਲਾਤ
1. ਇੱਕ 1.5 mL ਮਾਈਕ੍ਰੋਫਿਊਜ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ ਕੈਪਡ RNA ਅਤੇ RNase-ਮੁਕਤ H2O ਦੀ ਇੱਕ ਉਚਿਤ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ 16.0 μL ਦੀ ਅੰਤਮ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਜੋੜੋ।
2. 5 ਮਿੰਟ ਲਈ 65℃ 'ਤੇ ਗਰਮ ਕਰੋ ਅਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ ਬਰਫ਼-ਬਾਥ ਕਰੋ।
3. ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਕ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ (ਕੈਪਡ ਆਰਐਨਏ ਦੇ ਮੈਥਾਈਲੇਸ਼ਨ ਲਈ
10 ਤੋਂ ਘੱਟ
| ਕੰਪੋਨੈਂਟ | ਵਾਲੀਅਮ |
| ਵਿਕਾਰਿਤ ਕੈਪਡ RNA | 16 μL |
| 10X ਕੈਪਿੰਗ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਬਫਰ* | 2 μL |
| SAM (4 ਮਿ.ਮੀ.) | 1 μL |
| mRNA ਕੈਪ 2´-O-ਮਿਥਾਇਲਟ੍ਰਾਂਸਫੇਰੇਸ (50 U/μL) | 1 μL |
| ddH2O | ਤੋਂ 20 μL |
*10× ਕੈਪਿੰਗ ਰਿਐਕਸ਼ਨ ਬਫਰ: 500 mM Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT।
4. 1 ਘੰਟੇ ਲਈ 37℃ 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰੋ (200 nt ਤੋਂ ਘੱਟ ਟੀਚੇ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਲਈ 2 ਘੰਟੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ)।
ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ
ਮਾਈਕ੍ਰੋਇਨਜੈਕਸ਼ਨ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੌਰਾਨ mRNA ਸਮੀਕਰਨ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ।
ਵਰਤੋਂ 'ਤੇ ਨੋਟਸ
1. ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਨਿਊਕਲੀਜ਼-ਮੁਕਤ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਘੁਲਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਸਾਰੇ ਹੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਈਡੀਟੀਏ ਅਤੇ ਆਇਨ ਨਹੀਂ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ।
2. ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ ਦੇ 5'ਅੰਤ 'ਤੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਤੋਂ 5 ਮਿੰਟ ਪਹਿਲਾਂ ਸੈਂਪਲ RNA ਨੂੰ 65℃ 'ਤੇ ਗਰਮ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਗੁੰਝਲਦਾਰ 5 ´ -ਟਰਮੀਨਲ ਢਾਂਚੇ ਲਈ ਇਸਨੂੰ 10 ਮਿੰਟ ਤੱਕ ਵਧਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
