PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F(PNGase F) ਗਲਾਈਕੋਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤੋਂ ਲਗਭਗ ਸਾਰੇ N-ਲਿੰਕਡ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ ਸਭ ਤੋਂ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਤਰੀਕਾ ਹੈ।PNGase F ਇੱਕ ਐਮੀਡੇਸ ਹੈ, ਜੋ N-ਲਿੰਕਡ ਗਲਾਈਕੋਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤੋਂ ਉੱਚ ਮਾਨੋਜ਼, ਹਾਈਬ੍ਰਿਡ, ਅਤੇ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰਲੇ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ GlcNAc ਅਤੇ ਐਸਪੈਰਾਜੀਨ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਕੱਟਦਾ ਹੈ।
ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨ
ਇਹ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤੋਂ ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ ਲਾਭਦਾਇਕ ਹੈ।
ਤਿਆਰੀ ਅਤੇ ਨਿਰਧਾਰਨ
| ਦਿੱਖ | ਰੰਗ ਰਹਿਤ ਤਰਲ |
| ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸ਼ੁੱਧਤਾ | ≥95% (SDS-PAGE ਤੋਂ) |
| ਸਰਗਰਮੀ | ≥500,000 U/mL |
| ਐਕਸੋਗਲਾਈਕੋਸੀਡੇਸ | ਕੋਈ ਗਤੀਵਿਧੀ ਖੋਜੀ ਨਹੀਂ ਜਾ ਸਕੀ (ND) |
| ਐਂਡੋਗਲਾਈਕੋਸੀਡੇਸ F1 | ND |
| ਐਂਡੋਗਲਾਈਕੋਸੀਡੇਸ F2 | ND |
| ਐਂਡੋਗਲਾਈਕੋਸੀਡੇਸ F3 | ND |
| ਐਂਡੋਗਲਾਈਕੋਸੀਡੇਸ ਐੱਚ | ND |
| ਪ੍ਰੋਟੀਜ਼ | ND |
ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ
| EC ਨੰਬਰ | 3.5.1.52(ਸੂਖਮ ਜੀਵਾਣੂਆਂ ਤੋਂ ਮੁੜ ਸੰਜੋਗ) |
| ਅਣੂ ਭਾਰ | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| ਆਈਸੋਇਲੈਕਟ੍ਰਿਕ ਪੁਆਇੰਟ | 8. 14 |
| ਸਰਵੋਤਮ pH | 7.0-8.0 |
| ਸਰਵੋਤਮ ਤਾਪਮਾਨ | 65 ਡਿਗਰੀ ਸੈਂ |
| ਸਬਸਟਰੇਟ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ | GlcNAc ਅਤੇ asparagine ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਗਲਾਈਕੋਸੀਡਿਕ ਬਾਂਡਾਂ ਨੂੰ ਸਾਫ਼ ਕਰਨਾ ਚਿੱਤਰ.1 |
| ਮਾਨਤਾ ਸਾਈਟਾਂ | ਐਨ-ਲਿੰਕਡ ਗਲਾਈਕੈਨ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਕਿ α1-3 ਫਿਊਕੋਜ਼ ਨਾ ਹੋਵੇ ਚਿੱਤਰ 2 |
| ਐਕਟੀਵੇਟਰ | ਡੀ.ਟੀ.ਟੀ |
| ਰੋਕਣ ਵਾਲਾ | ਐੱਸ.ਡੀ.ਐੱਸ |
| ਸਟੋਰੇਜ਼ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ | -25 ~ -15 ℃ |
| ਹੀਟ ਇਨਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ | ਇੱਕ 20µL ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 1µL PNGase F ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਨੂੰ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 75 °C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਨ ਦੁਆਰਾ ਅਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। |
ਚਿੱਤਰ 1 PNGase F ਦੀ ਸਬਸਟਰੇਟ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ
ਚਿੱਤਰ 2 PNGase F ਦੀ ਮਾਨਤਾ ਬੈਠਦੀ ਹੈ।
ਜਦੋਂ ਅੰਦਰੂਨੀ GlcNAc ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ α1-3 ਫਿਊਕੋਜ਼ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ PNGase F ਗਲਾਈਕੋਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤੋਂ N-ਲਿੰਕਡ ਓਲੀਗੋਸੈਕਰਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਨਹੀਂ ਤੋੜ ਸਕਦਾ।ਇਹ ਸੋਧ ਪੌਦਿਆਂ ਅਤੇ ਕੁਝ ਕੀਟ ਗਲਾਈਕੋਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਿੱਚ ਆਮ ਹੈ।
Cਓਪੋਨੈਂਟਸ
|
| ਕੰਪੋਨੈਂਟਸ | ਧਿਆਨ ਟਿਕਾਉਣਾ |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×ਗਲਾਈਕੋਪ੍ਰੋਟੀਨ ਡਿਨੈਚਰਿੰਗ ਬਫਰ | 1000 μl |
| 3 | 10×ਗਲਾਈਕੋਬਫਰ 2 | 1000 μl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 μl |
ਯੂਨਿਟ ਦੀ ਪਰਿਭਾਸ਼ਾ
ਇੱਕ ਯੂਨਿਟ(U) ਨੂੰ 10 µL ਦੀ ਕੁੱਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਾਲੀਅਮ ਵਿੱਚ 37°C 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਵਿੱਚ 10 µg denatured RNase B ਤੋਂ 95% ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਵਜੋਂ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਪ੍ਰਤੀਕਰਮ ਦੇ ਹਾਲਾਤ
1. 1-20 µg ਗਲਾਈਕੋਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਡੀਓਨਾਈਜ਼ਡ ਪਾਣੀ ਨਾਲ ਘੋਲੋ, 1 µl 10×ਗਲਾਈਕੋਪ੍ਰੋਟੀਨ ਡੀਨੈਚਰਿੰਗ ਬਫਰ ਅਤੇ H2O (ਜੇਕਰ ਲੋੜ ਹੋਵੇ) ਨੂੰ ਮਿਲਾ ਕੇ 10 µl ਕੁੱਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਾਲੀਅਮ ਬਣਾਓ।
2.100 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰੋ, ਇਸਨੂੰ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਠੰਡਾ ਕਰੋ।
3.2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ ਅਤੇ ਮਿਕਸ ਕਰੋ।
4.1-2 µl PNGase F ਅਤੇ H ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ2O (ਜੇ ਜਰੂਰੀ ਹੋਵੇ) ਇੱਕ 20 μl ਕੁੱਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਾਲੀਅਮ ਅਤੇ ਮਿਸ਼ਰਣ ਬਣਾਉਣ ਲਈ।
5.60 ਮਿੰਟ ਲਈ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਕਰੋ।
6.SDS-PAGE ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਜਾਂ HPLC ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ।
