ਵੈਕਸੀਨਿਆ ਵਾਇਰਸ ਕੈਪਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮ
ਵੈਕਸੀਨੀਆ ਵਾਇਰਸ ਕੈਪਿੰਗ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਇੱਕ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਈ. ਕੋਲੀ ਸਟ੍ਰੇਨ ਤੋਂ ਲਿਆ ਗਿਆ ਹੈ ਜੋ ਵੈਕਸੀਨੀਆ ਕੈਪਿੰਗ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਲਈ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਸੰਭਾਲਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਸਿੰਗਲ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਦੋ ਸਬ-ਯੂਨਿਟ (D1 ਅਤੇ D12) ਨਾਲ ਬਣਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਵਿੱਚ ਤਿੰਨ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਗਤੀਵਿਧੀਆਂ ਹਨ (D1 ਸਬਯੂਨਿਟ ਦੁਆਰਾ RNA ਟ੍ਰਾਈਫੋਸਫੇਟੇਜ਼ ਅਤੇ guanylyltransferase ਅਤੇ D12 ਸਬਯੂਨਿਟ ਦੁਆਰਾ guanine methyltransferase)।ਵੈਕਸੀਨਿਆ ਵਾਇਰਸ ਕੈਪਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਕੈਪ ਢਾਂਚੇ ਦੇ ਗਠਨ ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ 7-ਮਿਥਾਈਲਗੁਆਨੀਲੇਟ ਕੈਪ ਢਾਂਚੇ (m7Gppp, Cap 0) ਨੂੰ RNA ਦੇ 5′ ਸਿਰੇ ਨਾਲ ਜੋੜ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਕੈਪ ਬਣਤਰ (ਕੈਪ 0) ਯੂਕੇਰੀਓਟਸ ਵਿੱਚ mRNA ਸਥਿਰਤਾ, ਆਵਾਜਾਈ ਅਤੇ ਅਨੁਵਾਦ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੁਆਰਾ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਕੈਪਿੰਗ ਕਰਨਾ ਇੱਕ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਅਤੇ ਸਰਲ ਤਰੀਕਾ ਹੈ ਜੋ ਵਿਟਰੋ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ, ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ, ਅਤੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਇਨਜੈਕਸ਼ਨ ਲਈ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ ਅਤੇ ਅਨੁਵਾਦ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸੁਧਾਰ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਕੰਪੋਨੈਂਟਸ
ਵੈਕਸੀਨਿਆ ਵਾਇਰਸ ਕੈਪਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮ (10 U/μL)
10×ਕੈਪਿੰਗ ਬਫਰ
ਸਟੋਰੇਜ਼ ਹਾਲਾਤ
-25～- ਸਟੋਰੇਜ਼ ਲਈ 15℃ (ਵਾਰ-ਵਾਰ ਫ੍ਰੀਜ਼-ਥੌ ਚੱਕਰਾਂ ਤੋਂ ਬਚੋ)
ਸਟੋਰੇਜ ਬਫਰ
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,
1mm DTT, 0. 1mm EDTA, 0. 1% ਟ੍ਰਾਈਟਨ ਐਕਸ- 100, 50% ਗਲਾਈਸਰੋਲ।
ਯੂਨਿਟ ਪਰਿਭਾਸ਼ਾ
ਵੈਕਸੀਨਿਆ ਵਾਇਰਸ ਕੈਪਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦੀ ਇੱਕ ਇਕਾਈ ਨੂੰ 37°C 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਵਿੱਚ GTP ਦੇ 10pmol ਨੂੰ ਇੱਕ 80nt ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਵਜੋਂ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।
ਗੁਣਵੱਤਾ ਕੰਟਰੋਲ
Exonuclease:ਵੈਕਸੀਨਿਆ ਵਾਇਰਸ ਕੈਪਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦਾ 10U 1μg λ-ਹਿੰਦ III ਡਾਇਜੈਸਟ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਨਾਲ 37 ℃ 'ਤੇ 16 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਕੋਈ ਵੀ ਗਿਰਾਵਟ ਨਹੀਂ ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਐਗਰੋਸ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਐਂਡੋਨਿਊਕਲੀਜ਼:ਵੈਕਸੀਨਿਆ ਵਾਇਰਸ ਕੈਪਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦਾ 10U 1μg λDNA ਦੇ ਨਾਲ 37℃ 'ਤੇ 16 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਐਗਰੋਜ਼ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੋਈ ਵੀ ਗਿਰਾਵਟ ਨਹੀਂ ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ।
ਨਿਕਸੇ:ਵੈਕਸੀਨਿਆ ਵਾਇਰਸ ਕੈਪਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦਾ 10U 1 μg pBR322 ਦੇ ਨਾਲ 37 ℃ 'ਤੇ 16 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ, ਐਗਰੋਜ਼ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੋਈ ਗਿਰਾਵਟ ਨਹੀਂ ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ।
RNase:ਵੈਕਸੀਨਿਆ ਵਾਇਰਸ ਕੈਪਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦਾ 10U 1.6μg MS2 RNA ਦੇ ਨਾਲ 37℃ 'ਤੇ 4 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਐਗਰੋਜ਼ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਿਤ ਕੋਈ ਗਿਰਾਵਟ ਪੈਦਾ ਨਹੀਂ ਕਰਦਾ।
1.ਕੋਲੀ ਡੀਐਨਏ:ਵੈਕਸੀਨਿਆ ਵਾਇਰਸ ਕੈਪਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦੇ 10U ਨੂੰ E. ਕੋਲੀ 16S rRNA ਲੋਕਸ ਲਈ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਨਾਲ TaqMan qPCR ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ E. ਕੋਲੀ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਲਈ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਈ. ਕੋਲੀ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਗੰਦਗੀ ≤1 ਈ. ਕੋਲੀ ਜੀਨੋਮ ਹੈ।
2.ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਐਂਡੋਟੌਕਸਿਨ: LAL-ਟੈਸਟ, ਚੀਨੀ ਫਾਰਮਾਕੋਪੀਆ IV 2020 ਐਡੀਸ਼ਨ, ਜੈੱਲ ਸੀਮਾ ਟੈਸਟ ਵਿਧੀ, ਆਮ ਨਿਯਮ (1143) ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ।ਬੈਕਟੀਰੀਅਲ ਐਂਡੋਟੌਕਸਿਨ ਸਮੱਗਰੀ ≤10 EU/mg ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।
ਪ੍ਰਤੀਕਰਮ ਸਿਸਟਮ ਅਤੇ ਹਾਲਾਤ
1. ਕੈਪਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ (ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਵਾਲੀਅਮ: 20 μL)
ਇਹ ਵਿਧੀ 10μg RNA (≥100 nt) ਦੀ ਕੈਪਿੰਗ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਨੂੰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਮੰਗਾਂ ਅਨੁਸਾਰ ਸਕੇਲ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
I) ਇੱਕ 1.5 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਮਾਈਕ੍ਰੋਫਿਊਜ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ 10μg RNA ਅਤੇ ਨਿਊਕਲੀਜ਼-ਮੁਕਤ H2O ਨੂੰ 15.0 μL ਦੀ ਅੰਤਮ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਜੋੜੋ।*10×ਕੈਪਿੰਗ ਬਫਰ: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)
2) 5 ਮਿੰਟ ਲਈ 65 ℃ 'ਤੇ ਗਰਮ ਕਰੋ ਅਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ ਬਰਫ਼ ਦਾ ਇਸ਼ਨਾਨ ਕਰੋ।
3) ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਕ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ
| Cਸਮਰਥਕ | Vਓਲੂਮ |
| ਵਿਕਾਰਿਤ RNA (≤10μg, length≥100 nt) | 15 μL |
| 10×ਕੈਪਿੰਗ ਬਫਰ* | 2 μL |
| GTP (10 ਮਿ.ਮੀ.) | 1 μL |
| SAM (2 ਮਿ.ਮੀ.) | 1 μL |
| ਵੈਕਸੀਨਿਆ ਵਾਇਰਸ ਕੈਪਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮ (10U/μL) | 1 μL |
*10×ਕੈਪਿੰਗ ਬਫਰ: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)
4) 37°C 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰੋ, ਆਰਐਨਏ ਹੁਣ ਬੰਦ ਹੋ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਲਈ ਤਿਆਰ ਹੈ।
2. 5′ ਟਰਮੀਨਲ ਲੇਬਲਿੰਗ ਪ੍ਰਤੀਕਰਮ (ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਵਾਲੀਅਮ: 20 μL)
ਇਹ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ 5´ ਟ੍ਰਾਈਫਾਸਫੇਟ ਵਾਲੇ RNA ਨੂੰ ਲੇਬਲ ਕਰਨ ਲਈ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਨੂੰ ਮੰਗਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਸਕੇਲ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਲੇਬਲ ਇਨਕਾਰਪੋਰੇਸ਼ਨ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ RNA: GTP ਦੇ ਮੋਲਰ ਅਨੁਪਾਤ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ RNA ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ GTP ਸਮੱਗਰੀ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਹੋਵੇਗੀ।
1) ਇੱਕ 1.5 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਮਾਈਕ੍ਰੋਫਿਊਜ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ RNA ਅਤੇ ਨਿਊਕਲੀਜ਼-ਮੁਕਤ H2O ਦੀ ਉਚਿਤ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ 14.0 μL ਦੀ ਅੰਤਮ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਜੋੜੋ।
2) 5 ਮਿੰਟ ਲਈ 65 ℃ 'ਤੇ ਗਰਮ ਕਰੋ ਅਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ ਬਰਫ਼ ਦਾ ਇਸ਼ਨਾਨ ਕਰੋ।
3) ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਕ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ।
| Cਸਮਰਥਕ | Vਓਲੂਮ |
| ਡੀਨੇਚਰਡ ਆਰ.ਐਨ.ਏ | 14 μL |
| 10×ਕੈਪਿੰਗ ਬਫਰ | 2 μL |
| GTP ਮਿਸ਼ਰਣ** | 2 μL |
| SAM (2 ਮਿ.ਮੀ.) | 1 μL |
| ਵੈਕਸੀਨਿਆ ਵਾਇਰਸ ਕੈਪਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮ (10U/μL) | 1 μL |
** GTP MIX GTP ਅਤੇ ਥੋੜ੍ਹੇ ਜਿਹੇ ਮਾਰਕਰਾਂ ਦਾ ਹਵਾਲਾ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।GTP ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਲਈ, ਵੇਖੋਨੋਟ 3 ਲਈ.
4) 37°C 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰੋ, RNA 5′ ਸਿਰੇ ਦਾ ਹੁਣ ਲੇਬਲ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ ਲਈ ਤਿਆਰ ਹੈ
ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ
1. ਅਨੁਵਾਦ ਅਸੇਸ/ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਅਨੁਵਾਦ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ mRNA ਕੈਪਿੰਗ
2. mRNA ਦੇ 5´ ਸਿਰੇ ਨੂੰ ਲੇਬਲ ਕਰਨਾ
ਵਰਤੋਂ 'ਤੇ ਨੋਟਸ
1.ਵੈਕਸੀਨੀਆ ਕੈਪਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੋਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਆਰਐਨਏ ਦੇ ਘੋਲ ਨੂੰ ਗਰਮ ਕਰਨ ਨਾਲ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟ ਦੇ 5'ਅੰਤ 'ਤੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਹਟ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਉੱਚ ਸੰਰਚਨਾ ਵਾਲੇ 5'ਅੰਤ ਵਾਲੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਾਂ ਲਈ ਸਮਾਂ 60 ਮਿੰਟਾਂ ਤੱਕ ਵਧਾਓ।
2. ਕੈਪਿੰਗ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ RNA ਨੂੰ ਵਰਤਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਨਿਊਕਲੀਜ਼-ਮੁਕਤ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਮੁਅੱਤਲ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।EDTA ਮੌਜੂਦ ਨਹੀਂ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਘੋਲ ਲੂਣ ਤੋਂ ਮੁਕਤ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।
3. 5´ ਸਿਰੇ ਨੂੰ ਲੇਬਲ ਕਰਨ ਲਈ, ਕੁੱਲ GTP ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ mRNA ਦੀ ਮੋਲਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਲਗਭਗ 1-3 ਗੁਣਾ ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।
4. ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਅਸਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਉੱਪਰ ਜਾਂ ਹੇਠਾਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।
