RTL ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ
RTL ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਇੱਕ ਆਰਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟ-ਨਿਰਭਰ DNA ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 3'→5' ਐਕਸੋਨੁਕਲੀਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੀ ਘਾਟ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਵਿੱਚ RNase H ਸਰਗਰਮੀ ਹੈ।ਇਹ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਇੱਕ ਪੂਰਕ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਦੇ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਇੱਕ ਨਮੂਨੇ ਵਜੋਂ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਪਹਿਲੇ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਸੀਡੀਐਨਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਖਾਸ ਕਰਕੇ RT-LAMP (ਲੂਪ-ਮੀਡੀਏਟਿਡ ਆਈਸੋਥਰਮਲ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ) ਲਈ।RTL ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ 1.0 ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸੁਧਾਰ ਹੋਇਆ ਹੈ, ਥਰਮਲ ਸਥਿਰਤਾ ਮਜ਼ਬੂਤ ਹੈ, ਅਤੇ 65°C 'ਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਧੇਰੇ ਸਥਿਰ ਹੈ।RTL ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ (ਗਲਾਈਸਰੋਲ ਫ੍ਰੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਲਾਇਓਫਿਲਾਈਜ਼ਡ ਤਿਆਰੀਆਂ, ਲਾਇਓਫਿਲਾਈਜ਼ਡ RT-LAMP ਰੀਐਜੈਂਟਸ ਆਦਿ ਨੂੰ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।
ਯੂਨਿਟ ਪਰਿਭਾਸ਼ਾ
ਇੱਕ ਯੂਨਿਟ ਟੈਂਪਲੇਟ-ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪੌਲੀ(A)•oligo(dT)25 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ 50°C 'ਤੇ 20 ਮਿੰਟਾਂ ਵਿੱਚ 1 nmol dTTP ਨੂੰ ਐਸਿਡ-ਪ੍ਰੀਪੀਟੇਬਲ ਸਮੱਗਰੀ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਦੀ ਹੈ।
ਕੰਪੋਨੈਂਟਸ
| ਕੰਪੋਨੈਂਟ | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ (ਗਲਾਈਸਰੋਲ-ਮੁਕਤ) (15U/μL) | 0.1 ਮਿ.ਲੀ | 1 ਮਿ.ਲੀ | 10 ਮਿ.ਲੀ |
| 10×HC RTL ਬਫਰ | 1.5 ਮਿ.ਲੀ | 4×1.5 ਮਿ.ਲੀ | 5×10 ਮਿ.ਲੀ |
| MgSO4 (100mm) | 1.5 ਮਿ.ਲੀ | 2×1.5 ਮਿ.ਲੀ | 3×10 ਮਿ.ਲੀ |
ਸਟੋਰੇਜ ਦੀ ਸਥਿਤੀ
0°C ਦੇ ਹੇਠਾਂ ਆਵਾਜਾਈ ਅਤੇ -25°C~-15°C 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇ।
ਗੁਣਵੱਤਾ ਕੰਟਰੋਲ
- ਦੀ ਬਕਾਇਆ ਗਤੀਵਿਧੀEndonuclease:ਇੱਕ 50 μL ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 1 μg λDNA ਅਤੇ RTL2.0 ਦੀਆਂ 15 ਯੂਨਿਟਾਂ 37 ℃ 'ਤੇ 16 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ, ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦੇ ਸਮਾਨ ਪੈਟਰਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।
- ਦੀ ਬਕਾਇਆ ਗਤੀਵਿਧੀExonuclease:ਇੱਕ 50 μL ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 1 μg ਹਿੰਦ Ⅲ ਪਾਚਣ ਵਾਲਾ λDNA ਅਤੇ RTL2.0 ਦੀਆਂ 15 ਯੂਨਿਟਾਂ 37 ℃ 'ਤੇ 16 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ, ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦੇ ਸਮਾਨ ਪੈਟਰਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।
- ਦੀ ਬਕਾਇਆ ਗਤੀਵਿਧੀਨਿਕਸੇ:ਇੱਕ 50 μL ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 1 μg ਸੁਪਰਕੋਇਲਡ pBR322 ਅਤੇ RTL2.0 ਦੀਆਂ 15 ਯੂਨਿਟਾਂ 37°C 'ਤੇ 4 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ, ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦੇ ਸਮਾਨ ਪੈਟਰਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।
- ਦੀ ਬਕਾਇਆ ਗਤੀਵਿਧੀRNase:ਇੱਕ 10 μL ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 0.48 μg MS2 RNA ਅਤੇ RTL2.0 ਦੀਆਂ 15 ਯੂਨਿਟਾਂ 37°C 'ਤੇ 4 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ, ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦੇ ਸਮਾਨ ਪੈਟਰਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।
- ਈ. ਕੋਲੀ gDNA:ਨਾਲ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆਈ.ਕੋਲੀਖਾਸ HCD ਖੋਜ ਕਿੱਟ，RTL2.0 ਦੇ 15 ਯੂਨਿਟਾਂ ਵਿੱਚ 1 ਤੋਂ ਘੱਟ ਹੈਈ. ਕੋਲੀਜੀਨੋਮ
ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਸੈੱਟਅੱਪ
cDNA ਸਿੰਥੇਸਿਸ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ
| ਕੰਪੋਨੈਂਟਸ | ਵਾਲੀਅਮ |
| ਟੈਂਪਲੇਟ RNA ਏ | ਵਿਕਲਪਿਕ |
| ਓਲੀਗੋ(dT) 18~25(50uM) ਜਾਂ ਰੈਂਡਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਮਿਕਸ (60uM) | 2 μL |
| dNTP ਮਿਕਸ (10mm ਹਰੇਕ) | 1 μL |
| RNase ਇਨਿਹਿਬਟਰ (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL ਬਫਰ | 2 μL |
| ਨਿਊਕਲੀਜ਼-ਮੁਕਤ ਪਾਣੀ | 20 μL ਤੱਕ |
ਨੋਟ:
1) ਕੁੱਲ RNA ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਖੁਰਾਕ 1ng~1μg ਹੈ
2) mRNA ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਖੁਰਾਕ 50ng ~ 100ng ਸੀ
ਥਰਮੋ-ਇੱਕ ਰੁਟੀਨ ਲਈ ਸਾਈਕਲਿੰਗ ਸ਼ਰਤਾਂ ਪ੍ਰਤੀਕਰਮ:
| ਤਾਪਮਾਨ (°C) | ਸਮਾਂ |
| 25 ਡਿਗਰੀ ਸੈਂa | 5 ਮਿੰਟ |
| 55 ਡਿਗਰੀ ਸੈਂ | 10 ਮਿੰਟb |
| 80 ਡਿਗਰੀ ਸੈਂ | 10 ਮਿੰਟ |
ਨੋਟ:
1) ਜੇਕਰ ਰੈਂਡਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਮਿਕਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ 25°C 'ਤੇ ਇੱਕ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਪੜਾਅ।
2) ਜੇਕਰ ਟਾਰਗੇਟ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਮਿਕਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ 10~30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 55°C 'ਤੇ ਇੱਕ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਪੜਾਅ।
RT-LAMP ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ
| ਕੰਪੋਨੈਂਟਸ | ਵਾਲੀਅਮ | ਅੰਤਮ ਇਕਾਗਰਤਾ |
| ਟੈਂਪਲੇਟ RNA | ਵਿਕਲਪਿਕ | ≥10 ਕਾਪੀਆਂ |
| dNTP ਮਿਕਸ (10mm) | 3.5 μL | 1.4 ਮਿ.ਮੀ |
| FIP/BIP ਪ੍ਰਾਈਮਰ (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 ਪ੍ਰਾਈਮਰ (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB ਪ੍ਰਾਈਮਰ (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase ਇਨਿਹਿਬਟਰ (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ |
| RTL ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ |
| Bst V2 DNA ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ (8U/μL) | 1 μL | 8 U/ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ |
| MgSO4 (100mm) | 1.5 μL | 6 mM (ਕੁੱਲ 8 mM) |
| 10×HC RTL ਬਫ਼ਰ (ਜਾਂ 10×HC Bst V2 ਬਫ਼ਰ) | 2.5 μL | 1 × (2mm Mg2+) |
| ਨਿਊਕਲੀਜ਼-ਮੁਕਤ ਪਾਣੀ | 25 μL ਤੱਕ | - |
ਨੋਟ:
1) ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਲਈ ਥੋੜ੍ਹੇ ਸਮੇਂ ਲਈ vortexing ਅਤੇ centrifuge ਦੁਆਰਾ ਮਿਲਾਓ।1 ਘੰਟੇ ਲਈ 65 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਲਗਾਤਾਰ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰੋ।
2) ਦੋ ਬਫਰ ਆਪਸ ਵਿੱਚ ਕੰਮ ਕਰਨ ਯੋਗ ਹਨ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਰਚਨਾ ਇੱਕੋ ਜਿਹੀ ਹੈ।
ਨੋਟਸ
1. -20 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਕੀਤੇ ਜਾਣ 'ਤੇ ਇਹ ਉਤਪਾਦ ਚਿੱਟਾ ਠੋਸ ਬਣ ਜਾਵੇਗਾ।ਇਸਨੂੰ -20 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤੋਂ ਬਾਹਰ ਕੱਢੋ ਅਤੇ ਲਗਭਗ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਰੱਖੋ।ਪਿਘਲਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਸ ਨੂੰ ਹਿਲਾ ਕੇ ਅਤੇ ਮਿਕਸ ਕਰਕੇ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
2. cDNA ਉਤਪਾਦ ਨੂੰ -20°C ਜਾਂ -80°C 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜਾਂ PCR ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਲਈ ਤੁਰੰਤ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
3. RNase ਗੰਦਗੀ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ, ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਖੇਤਰ ਨੂੰ ਸਾਫ਼ ਰੱਖੋ, ਅਤੇ ਕਾਰਵਾਈ ਦੌਰਾਨ ਸਾਫ਼ ਦਸਤਾਨੇ ਅਤੇ ਮਾਸਕ ਪਹਿਨੋ।
